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준
- 음성대조물질 : DMSO
기
- 시 험 물 질 : arsanilic acid, danofloxacin, mercury
술
- 공 시 배 지 : neural medium, DMEM/F12K, N2 serum-free supplement (x100),
활
B27 serum-free supplement (x50)
용
- 시 험 기 기 : 세포영상분석기(Cell imaging High Content Screening, Cellomics),
형광분석기(fluorescence microplate reader)
2) 방 법
?신경분화배지 제조
- DMEM/F12K1+N2 serum-free supplement+B27 serum-free supplement
?Gelatin이 코팅된 12 well 플레이트에 마우스 배아줄기세포 (NVRQS-ES 11F)
5x102cells/well를 분주하여 24시간동안 37℃, 5% CO2 조건에서하루동안 배양
?신경분화배지와 함께 단계별로 희석한 시험물질을 각 용량별로 well에 1㎖씩 투
여하고 37℃, 5% CO2 조건에서반응
?신경세포 분화 주기별 확인 : 신경분화배지로 교체 후 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16
일에 분화지표의 단백질(Oct4, GABA-R, GFAP, Nestin, TUJ-1, MAP2) 발현을
확인
- Oct4, GABA-R, GFAP, Nestin, TUJ-1, MAP2 antibody solution 500㎕를 well
에 넣고, 실온에서 1시간 동안 반응
- Secondary antibody와 Hoechst dye 500㎕를 각 well에 넣은 다음 실온에서 45
분 동안 반응
?세포영상분석기(Cell imaging High Content Screening, Cellomics)로 형광도 측정
?신경분화 독성평가 기준
- Oct4의 형광도가 대조군 세포에 비해 통계학적으로 유의성있게 감소하고
GABA-R, GFAP, Nestin, TUJ-1, MAP2 형광도가 대조군 세포에 비해 통계학
적으로 유의성 있게 증가하면 신경분화에 영향을 주는 것으로 평가한다.
?아세틸콜린 에스테라제 측정에 의한 신경독성 평가
- 시험물질에 지속적으로 노출된 신경분화세포를 수거하여 아세틸콜린 에스테라
제 활성을 측정하여 대조군 세포에 비해 통계학적으로 유의성 있게 감소하면
신경 기능에 영향을 주는 것으로 평가한다.
6. 색인용어 마우스배아줄기세포, 신경전구세포, 신경세포, 신경독성
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