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② Gelatin이 코팅된 12 well 플레이트에 마우스 배아줄기세포 (NVRQS-ES 11F)
연
2
5x10
cells/well
구
성
1㎖를 분주하여 24시간동안 37℃, 5% CO2 조건에서하루동안 배양한다.
과
Plate design - 12well (3 replicates) x 2 plates
활
용
(한 물질에 대해서 6가지 지표확인 하려면 총 12 plate)
집
ctrl
st1(low)
st2
st3
st4
st5
st6
st7(high)
③ 시험물질 제조시 시험물질의 특성에 따라 용매는 DMSO를 사용하고 7단계로 희석하
여 사용한다. 음성대조군은 DMSO(0.5%)로 한다.
④ 신경분화배지와 함께 단계별로 희석한 시험물질을 각 용량별로 well에 1㎖씩 투여하
고 37℃, 5% CO2 조건에서반응시킨다.
⑤ 신경세포 분화 주기별 확인 : 신경분화배지로 교체 후 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16일
에 분화지표의 단백질 발현을 확인
- 6일 동안 공시물질 처리 후 단백질 발현 확인
- 8일 동안 공시물질 처리 후 단백질 발현 확인
- 8일 동안 분화시킨 후 6일 동안 공시물질처리 후 단백질 발현 확인
- 8일 동안 공시물질 처리 후 단백질 발현 확인
⑥ 배지를 제거하고(aspiration) 고정액(fixation solution) 500㎕ 를 각 well에 넣는다. 실
온 hood에서 15분 동안 반응시킨 후 1× wash buffer 500㎕/well 로 두 번 세척한다.
⑦ Permeabilization buffer 500㎕ 를 well에 넣고 실온에서 15분 동안 반응시킨 후 wash
buffer 500㎕/well 로 두 번 세척한다.
⑧ Blocking buffer 500㎕를 각 well에 넣고 실온에서 15분 동안 반응시킨 후 blocking
buffer를 제거하고(aspiration) Oct4, GABA-R, GFAP, Nestin, TUJ-1, MAP2
antibody solution 500㎕를 well에 넣는다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨다.
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