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- 분화확인 지표 (항체희석배율 1:200)
표
Oct4 - non differentiation/differentiation
준
GABA - inhibitory transmitter
기
Nestin - intermediate filament protein
술
활
TUJ-1 - neuron specific B-tubulin
용
MAP2 - microtubules
GFAP - astrocyte(glial cell)
⑨ Antibody solution을 제거하고 wash buffer 100㎕/well로 두 번 세척한다.
⑩ Wash buffer를 제거하고(aspiration) secondary antibody와 Hoechst dye 500㎕를 각
well에 넣는다. 실온에서 45분 동안 반응시킨다.(빛 차단)
⑪ Secondary antibody를 제거하고 wash buffer 500㎕/well 로 두 번 세척한다.
⑫ Wash buffer 200㎕/well를 채운 후 sealing tape으로 밀봉하여 분석 전까지 4℃에서
보관한다.
3) HCS analyzer 분석 조건
① 렌즈배율과 well당 분석할 최대 field 수를 지정한다.
② 세포독성에 맞는 assay algorism을 선택하고 형광 channel 개수와 각 channel에서 사
용할 형광dye를 지정한다.
③ 플레이트를 기기에 넣고 시험적으로 한 well의 노출시간과 object selection parameter
를 조절하여 최적의 초첨을 맞춘다.
④ Algorithm을 돌려 분석할 핵과 세포질의 범위를 조정한다.
⑤ Plate 저장이름과 측정할 well을 선택하고 측정 및 분석을 시작한다.
⑥ 전체 cell수를 ValidObjectCount로, 분석 가능한 cell수를 ObjectCountPerField로 지정
한 well당 측정field 수에 맞게 분석하였는지를 ValidFieldCount로 확인한다.
4) 아세틸콜린 에스테라제(Acetylcholine esterase) 측정에 의한 신경독성 평가
① 시료 희석
- 시험군 시료
: 1X reaction buffer에 희석
- 1차 양성 대조군
: 100 U/㎖ acetylchoinesterase stock solution + 1X reaction buffer
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