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2) 시험방법
표
① 조혈분화배지 제조
준
예) total 500㎖ 제조시,
기
- 동일 배지조성 : FBS (fetal bovine serum) 75㎖ +100x penicillin/streptomycin 5㎖ +
술
활
10mg/㎖ bovine insulin 0.5㎖ + transferin 2.5mg + 5㎍ /㎖ sodium
용
selenite 0.5㎖ + ascorbic acid 25mg + 10M a-monothioglycerol 22㎕
- 1차 조혈분화 배지 : IMDM 410㎖ + 10㎍ /㎖ VEGF 1㎖ + 50㎍ /㎖ IGF-II 2㎖
- 2차 조혈분화 배지 : IMDM 408.5㎖ + 10㎍ /㎖ SCF 2.5㎖ + 10㎍ /㎖ erythropoietin 1
㎖ + 10ug/㎖ IL-3 0.5㎖ + 1mM dexamethasone 0.5㎖
② 마우스 배아줄기세포를 분주하기 하루 전날에 24 well plate에 OP9 feeder cell
4
5x10
cell을 미리 분주하여 24시간동안 37℃, 5% CO2 조건에서하루동안 배양한다.
3
③ 24시간 후 마우스 배아줄기세포를 3x10
cell 분주하고 24시간이 지나면 1차 혈액분화
배지로 교체한다.
④ 2일에 한번씩 배지교체를 해주고 4일이 지난 후에는 2차 혈액분화배지로 교체한다.
⑤ 2일에 한번씩 배지교체를 하며 40일 동안 유지한다.
⑥ 1차, 2차 조혈분화배지와 함께 단계별로 희석한 시험물질을 각 용량별로 well에 1㎖씩
투여하고 37℃, 5% CO2 조건에서반응시킨다.
⑤ 조혈세포 분화 주기별 확인 : 조혈분화배지로 교체 후 40일에 분화지표의 단백질 발
현을 확인
⑥ 배지를 제거하고(aspiration) 1X PBS로 두 번 세척한다. 고정액(fixation solution) 500
㎕ 를 각 well에 넣는다. 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 1× wash buffer 500㎕/well
로 두 번 세척한다.
⑦ Permeabilization buffer 500㎕ 를 well에 넣고 실온에서 15분 동안 반응시킨 후 wash
buffer 500㎕/well 로 두 번 세척한다.
⑧ Blocking buffer 500㎕를 각 well에 넣고 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 blocking
buffer를 제거하고(aspiration) CD117, CD34, Gr-1, CD45, Ter119 및 Oct4, SSEA1
antibody solution을 희석한 500㎕를 well에 넣는다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨다.
- 분화확인 지표 (항체희석배율 1:200)
CD117, CD34 - hematopoietic stem cell
Gr-1 - granulocyte
33

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