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RT&Nested-PCR 검사법
특이적인 primer를 설계
ⅱ) 동일한 온도조건에서 작동하는 종 특이적 primer를 바이러스 별로
최소 20조합 이상 설계하여 선발에 이용
- 프라이머의 선발: 설계된 primer를 4단계에 걸친 선발을 통하여
진단용 primer를 선발
ⅰ) 1단계 : 대상바이러스와의 특이적 반응
ⅱ) 2단계 : 유연관계 바이러스와의 비특이적 반응
ⅲ) 3단계 : 기주관련 바이러스와의 바특이적 반응
ⅳ) 4단계 : 기주의 genomic DNA와의 비특이적 반응
- 염기서열 분석
ⅰ) 증폭한 산물의 염기서열을 분석, 동종 여부를 BLAST분석을 통해 진단의
정확성을 확정
- 양성대조구 확보
ⅰ) 염기서열 분석을 통해 확인한 증폭산물을 양성대조구로 제작,
활용
ⅱ) 선발된 primer 조합의 모든 영역에서 작동되는 양성대조구를 제작
- 검증시스템 도입 (Nested-PCR 검사법)
ⅰ) 양성반응에 대한 검증 시스템 개발
ⅱ) 염기서열 분석을 하지 않아도 손쉽게 양성반응의 진위 여부를 검증
- 선발 primer의 효율성 검증
ⅰ) End­point PCR : RNA를 10배씩 희석하여 선발된 primer가 어느
정도의 민감도를 가지고 있는지를 상대적으로 비교하여, 가장 좋은
민감도를 가진 primer를 최종선발
ⅱ) 선발 primer 이외의 primer는 2차로 분류하여 크로스­체크용
으로 활용
○ 2010년 (2년차)
- 표준시료의 확보: 금지품 수입허가를 통해 감염시료 확보를 통한 2차년도
표준시료 확보
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