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RT&Nested-PCR 검사법
TRSV의 입자는 지름이 약 28 nm인 정방형이며, 핵산은 single­stranded RNA로 약
7,500 bp와 3,900 bp의 2 종류가 있다. 본 연구에서는 핵산의 segment RNA­2 (3,900
bp)를 대상으로 진단용 primer를 설계하였다.
(1) TRSV의 진단용 primer 설계와 조합
TRSV의 진단용 primer 설계를 위하여 미국 국립생물정보센터로부터 TRSV의 5가지 strain과
분류학적으로 유사한 Secoviridae 3종의 염기서열을 다운로드 하였다 (표 1).
다운로드한 8종의 염기서열은 'fasta' format으로 정렬한 뒤, sequence alignment program인
DNAMAN package를 사용하여 multiple alignment 하였다. 그 후 TRSV의 종 특이적인
서열을 탐색하였고, 약 4 kb중 ‘1,896­3,893’ 부분을 대상으로 진단용 primer를 설계하였다
(그림 2).
설계한 primer는 정방향 10가지와 역방향 12가지의 총 22가지로 (표 2), 이를 조합하여
PCR 증폭이 가능한 48가지 조합을 선발하였고, 각각의 RT­PCR 산물의 예상 크기는
(length, bp)는 표 3과 같다.
표 1. 종 특이적 염기서열 탐색을 위해 사용한 바이러스 정보
GeneBank accession No.
Virus name (strain or isolate)
Acronym
(Length, bp)
Tobacco ringspot virus
TRSV
AY363727 (3,929)
Tobacco ringspot virus (United Kingdom)
TRSV
AF461163 (2,016)
Tobacco ringspot virus (Iran)
TRSV
AF461164 (2,016)
Tobacco ringspot virus
TRSV
AY787756 (1,548)
Tobacco ringspot virus
TRSV
L09205 (2,018)
Arabis mosaic virus
ArMV
NC_006056 (3,820)
Grapevine fanleaf virus
GFLV
NC_003623 (3,774)
Raspberry ringspot virus
RpRSV
NC_005267 (3,914)
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