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에서 사용한 곤충세포 발현 최적화 ORF2 유전자의 N 말단에 6X histidin이 부착하는 발현
특
형태는 발현 세포를 파쇄하여 발현확인 및 Ni-NTA를 통한 정제를 편리하게 할 수 있으며,
허
추가적으로 배양 상층액에서는 별도의 정제?농축 과정 없이도 함유된 고농도의 VLPs를
출
항원으로 적용할 수 있다는 점에서 돼지 E형 간염바이러스 예방백신 및 진단에 매우 유용
원
하게 적용할 수 있는 항원으로 사용할 수 있는 장점이 있다.
?
③ 발명의 구성
국
본 발명의 돼지 E형 간염(swHEV)의 백신용 재조합 항원은 돼지 E형간염(swHEV)의 캡시
내
드단백질에 대한 유전자(ORF2 : 1737bp, AY575859)를 곤충 세포(Sf9) 발현에 적합하도록
?
최적화 단계를 거친 다음 인공 합성하였다.(Bioneer, Korea) 합성된 유전자는 BamHI 및
XhoI 제한효소를 이용하여 pFastBac HTA(Invitrogen사) 벡터에 클로닝하였다. 이후 상세한
클로닝 및 발현 방법은 시약 제공 회사의 방법에 따라 실시하였다. 재조합 Bacmid(베큘
로바이러스 DNA)가 함유된 E.coli 콜로니를 최종 선발하여 Bacmid를 순수 정제한 다음
곤충세포(Sf9,)에 트렌스펙션(Tranfection)하여 발현 용 재조합 베큘로바이러스(이후
SwHEV ORF2 HTA Baculovirus)를 작성하였다. 작성된 SwHEV ORF2 HTA Baculovirus을
소태아혈청이 함유되지 않은 배양배지(Express Hi-Five medium, Invitrogen)로 배양한 곤충
세포(Hi-five cell, Trichoplusia ni, Invitrogen)에 감염시켜 이후 발현 항원으로 사용하였다.
본 발명을 통해 개발된 SwHEV ORF2 발현 단백질은 발현 곤충세포 내에서 대량 발현이
확인될 뿐만 아니라 세포 배양 상층액으로도 대량 분비되는 것이 확인되었다. 발현하는
세포를 파쇄한 후 Ni-NTA 레진을 이용하여 간편하게 대량 정제 가능 하였다. 또한, 소태아
혈청이 함유되지 않은 배지로 배양하여 수거된 세포배양 상층액은 별도의 정제, 농축 과정
없이 배양 상층액 원액에서 전자현미경을 통한 바이러스유사입자(Virus like particles,
VLP)형성을 확인할 수 있었다.
돼지 E형간염바이러스(SwHEV)의 ORF2 단백질 발현 여부는 발현 세포 및 배양 상층액에
대하여 표지 아미노산인 6X histidine 특이 항체 및 다양한 SwHEV 양성 항체를 이용한
웨스턴 블로팅법을 통해 확인함으로서 향후 백신 등 예방 항원으로 활용 가능성을 확인할
수 있었다.
추가적으로 진단용 항원으로서의 가능성을 확인하기 위해 대량 항체 스크리닝 방법인
ELISA 항원으로 적용한 결과 다양한 HEV 양성 항체 및 음성항체에 대해서 감별이 가능
함을 확인할 수 있었다.
④ 발명의 효과
본 발명에 의해 현재까지 개발이 되지 않은 돼지 등 동물용 E형 간염 백신(swHEV)를 개발
돼지 등 동물에 적용함으로서 인수공통전염병으로 보고되고 있는 E형 간염의 질병 전파를
사전에 차단하여 공중보건학적으로 기여할 수 있다.
또한, 표지 아미노산(6X histidine) 부착된 형태의 SwHEV ORF2단백질을 발현함으로서 이후
정제 및 발현 확인을 매우 편리하게 수행할 수 있는 장점과 함께 소태아혈청이 포함되지
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