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2. Transfer plate
PBST(PBS
0.05% Tween 20
이 함유된 것
) diluent buffer
용액을
열 모든
well
125
씩 가한 후 백신으로부터 추출한
test
항원과
reference
250
에서
열까지 첨가한 다음
열 시료
125
씩을
B well
로 옮겨 단
계별로
2
128
배까지 희석하고 맨 마지막
열은
blank
로 사용한다
3.
코팅된
96 well ELISA plate
PBS-Tween 20 (PBST)
으로
3
4. 96 well ELISA plate
transfer plate
에서 제조한 항원 희석액을
well
100 ㎕
씩 분
주한 후
, 96 well ELISA plate
를 밀폐하여 교반기를 사용하여
120 rpm(20 25 )
에서
30
분 동안 배양한 다음
PBST
용액으로
3
회 세척한다
5.
단크론 항체 희석액
(PBS-Tween 20
희석액에
2.0% bovine albumin fraction V
가 함
유된 것 으로 마우스 유래
987P
단크론 항체를 희석하여
well
100
씩 옮긴 후
, 96
well ELISA plate
를 밀폐한 다음 교반기를 사용하여
120 rpm(20 25 )
에서
30
분 배
양 후에
PBST
용액으로
3
회 세척한다
6. Conjugate
희석액
(PBS-Tween 20
용액에
1.0%
정상 토끼 혈청을 함유된 것 으로
peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG
를 적절하게 희석한 다음
ELISA plate
모든
well
100
씩 첨가한 후 밀폐하여 교반기를 사용하여
100 120 rpm(20 2
5 )
에서
30
분 배양한 후에
PBST
용액으로
3
회 세척한다
7.
사용 전
15
분 이내에 만든 기질액
(OPD
또는
ABTS substrate system)
well
100
씩 옮긴 후
, 96 well ELISA plate
를 밀폐하여 교반기를 사용하여
120 rpm(20 2
5 )
에서
10
분 동안 배양한다
8. OPD
기질액을 사용할 경우에는
stop solution(2.5M H
을 각
well
100 ㎕
첨가
2
4
하여 반응을 중지시키고
, ABTS
기질액을 사용할 경우에는
stop solution
첨가 없이
ELISA reader (with dual wave lengths 490
test, 650
reference(OPD)
또는
405
test, 490
reference(ABTS)
로 신속하게 흡광도를 측정한다
<
별첨
4>
대장균
K88 pilus
항원 역가시험법
Double antibody sandwich ELISA method for K88 antigen
1.
대장균
항원 특이 단크론 항체
(Mab)
는 차가운
0.05M carbonate coating
buffer(pH 9.6)
로 제조회사에서 권장하는 비율대로 적절하게 희석한 후에
ELISA
plate
의 각
well
100
씩 넣고
2 7
～ ℃
에서 하룻밤 동안 둔다
2. 96 well ELISA plate
를 실온에서 평형화시킨 다음
PBST(PBS
0.05% Tween 20
함유된 것
) diluent buffer
용액을
열 모든
well
125
씩 가한 후 백신으로부
터 추출한
test
항원과
reference
항원
250
에서
열까지 첨가한 다음
시료
125
씩을
B well
로 옮겨 단계별로 계단 희석하고 맨 마지막
열은
blank
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1-2-02-10

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