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[ 붙임 ] 1. 꿀벌 이스라엘급성마비병의 RT(Reverse Transcription) PCR 진단법
연
구
1. 준비물
성
○ 가검시료 : 바이러스성 질병에 감염되었거나 의심되는 꿀벌, 애벌레 등 시료
과
○ PCR 재료 : RNA extraction kit, One-step RT-PCR kit(또는 cDNA synthesis kit, PCR kit) 등
활
용
2. PCR 프라이머
집
○ 프라이머 제작
Name
Primer sequence(5' →3')
size(bp)
Forward 5`-GAT TTG AGA GAT GTA TTT CCT TCT GCG G-3`
IAPV
725
Reverse 5`-ACA CTT GCG TTG GTC CTG AAT GTT AAT GG-3`
3. 방법
1) One step RT PCR(예 : Qiagen Onestep RT-PCR kit 사용 시)
○ RNA 추출 키트를 이용하여 가검물(꿀벌, 애벌레 등)로부터 total RNA를 추출하여
Template로 사용한다.
○ One Step RT-PCR kit를 이용하여 각각의 primer, total RNA 등을 아래의 비율과 같이
잘 섞어준다.
5X ONESTEP RT-PCR Buffer
10.0㎕
dNTP Mix
2.0㎕
Primer A
1.0㎕
Primer B
1.0㎕
ONESTEP RT-PCR Buffer Enzyme Mix
2.0㎕
RNA(test sample)
5.0㎕
Total
50.0㎕
○ Thermocycler를 이용하여 PCR을 다음과 같이 실시한다.
PCR 단계
반응시간 및 온도
증폭 Cycle
50℃, 30min
Reverse
1 cycle
Transcription
95℃, 15min
Denaturation
95℃, 30sec
Annealing
52℃, 30sec
34 cycles
Extension
72℃, 60sec
Final Extension
72℃, 5min
1 cycle
378

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