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[ 붙임 ] 1. 조류 메타뉴모바이러스 감염증 유전자 검사법 개선
연
구
1. 진단방법 개요
성
가금류(닭 및 칠면조)의 호흡기 질병인 조류 메타뉴모바이러스 감염이 의심되는 닭의 가검물에
과
대하여 기존 프라이머를 개선하여 적용함으로써 조류 메타뉴모바이러스 감염증 진단 감도를
활
향상하고 진단유전형을 확대한 항원검사법을 보급하고자 함.
용
집
2. 시험방법
가. 재료
1) 임상증상이 있는 개체의 기관 및 비갑계 swab 또는 유제액
2) 유전자 추출 및 증폭에 필요한 시약
3) PCR machine
4) Gel documentation system
나. 방법
조류 메타뉴모 바이러스의 N protein 유전자를 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcriptase
- Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 기법을 이용하여 특이적으로 검출함.
(1) RNA 추출 : 상용화 제품 사용(Qiagen, Intron 등)
(2) 반응시약 : 상용화 제품 사용((예) Accupower PCR premix, Ex-taq polymerase 등)
(3) RT-PCR primers
PCR
Primes
Sequences
Expected sizes
비고
N1-S
5'-ATGTCTCTTGAAAGTATTAGRCTC-3'
First
826bp
NX-AS
5'-CATGGCCCAACATKATRTT-3'
ND-S
5'-AGYAGGATGGAGAGCCTSTTTG-3'
Nested
116bp
NX-AS
5'-CATGGCCCAACATKATRTT-3'
(4) RT-PCR 반응 조건
단 계
온 도
반응시간
증폭횟수
Reverse transcription
50℃
30min
1cycle
Initial PCR activation
95℃
15min
1cycle
Denaturation
94℃
1min
Annealing/nested annealing
50℃/55℃
30sec/30sec
35cycle
Extention
72℃
1min
Final extention
72℃
5min
1cycle
* PCR 수행시 annealing temp 50℃, nested PCR 수행시 55℃ 반응
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