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* 시약제조
표
1) PMCA conversion buffer
준
1X PBS 47.6㎖, 5M NaCl 1.5㎖, Triton X-100 0.5㎖, 0.5M EDTA 0.4㎖,
Complete protease Inhibitor cocktail 1 tablet 0.05% Digitonin(sigma)
기
2) proteinase K : 1mg/㎖ in 50mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM CaCl2
술
3) Pefablock : 0.1M in DDW
활
4) Collagenase : 20mg/㎖ in DDW
용
5) DNase I : 10mg/㎖ in 50% glycerol, 10mM Tris-HCl(pH7.5) 10mMmgCl2
6) 2XSample buffer : 사용중에 소량은 실온보관가능 장기간 보존은 4℃에서 보관
1M Tris-HCl(pH6.8)
1.25㎖
Glycerol
1㎖
0.5M EDTA(pH8.0)
120㎕
β-Mercaptoethanol
800㎕
1% bromophenol blue
800㎕
SDS
1g
Urea
4.8g
up to 20㎖
나. 생체외 변형프리온 증폭 방법(PMCA)
1) 각 시료별로 아래와 같이 시료와 정상프리온의 비율을 정하여 준비한다
c
- 뇌조직 : “가”에서 준비된 정상프리온(PrP
) 90㎕, 시료 10㎕
c
- 인두후 림프절 : “가”에서 준비된 정상프리온(PrP
) 80㎕, 시료 20㎕
c
- 음성대조군 : “가”에서 준비된 정상프리온(PrP
) 90㎕, 음성시료 10㎕
2) PMCA반응을 위하여 100㎕ 반응액을 PCR 반응 tube(0.2㎖)에 넣는다
3) 37℃ water bath에 3시간 반응시킨다.
4) misonix sonicator를 이용 아래와 같은 program으로 1회 반응한다.
- 정상프리온으로 프리온 과발현 형질전환 마우스를 이용할 경우(8시간)
potency 5, pulse on 30초, pulse off 29분 30초 : 48cycles
- 정상프리온으로 동종의 가축(엘크 등)을 이용할 경우(24시간)
potency 5, pulse on 30초, pulse off 9분 30초 : 48cycles
다. 결과확인(western blot)
1) PMCA 증폭산물 20㎕를 새 PCR tube에 넣는다.
2) DNase I(1mg/㎖) 8㎕, Collagenase(20mg/㎖) 5㎕ 첨가한다.
3) 37℃에서 1시간 반응한다.
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