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4) protienase K(PK, 1mg/㎖)를 동일종을 정상프리온으로 사용한 경우 4㎕(200㎍/㎖)를 형질
연
전환 마우스를 정상프리온으로 사용한 경우는 16㎕(400㎍/㎖)를 넣는다.
구
5) 37℃ 1시간 반응한다.
성
6) 0.1M pefablock을 1㎕(동일종), 4㎕(Tg mice)를 넣는다.
과
※ 이시기에 에펜도르프 튜브를 이용하여 시료를 옮긴다.
활
7) 20,000g 15min 20℃ 조건으로 원심을 실시한다.
용
8) 상층액을 완전히 제거한다.
집
9) pellet에 4% SDS를 20㎕ 첨가한다.
10) 초음파를 아래의 조건으로 실시한다.
: potency 40% : pulse on 5 : 00, pulse 1 : 00 : time 1분
11) pellet을 100℃ 5min반응시키되 도중에 flash하면서 잘 녹인다.
12) 400㎕의 차가운 메탄올(-20C에 두었던 것) 첨가한다.
13) -20C에 30분 이상 방치하거나 이 상태로 보존도 가능하다.
14) 20,000g 10min 20℃ 조건으로 원심을 실시한다.
15) 상층액 버리고 5min동안 메탄올 증발시킨다.
16) 1X sample buffer 20㎕넣고 100℃, 5min 반응시킨다.
17) SDS-PAGE gel로 전개 후 PVDF막에 전사한다.
18) blocking buffer로 30분간 반응한다
19) 일차항체(S1)를 0.5mg/㎖이 되도록 희석하여 1시간 반응시킨다.
20) TBST로 5분간 3회 세척 한다.
21) 이차항체(anti-rabbit-AP labeled)를 0.25㎍/㎖이 도록 희석하여 반응한다 .
22) TBST로 5분간 3회 세척한다.
23) luminiscence buffer를 넣어준 후 5분간 반응시킨다.
24) CDP-star를 50배(12.5mM)나 또는 100배(25mM)로 luminiscence buffer에 희석한다.
25) 유리판위에 막을 올려놓고 희석한 CDP-star를 부어준후 실온에서 5분간 반응시킨다.
26) 막에서 과도한 액체를 제거하고 랩으로 붙여준 후 차례로 developer와 fixer에 담그어
시그널을 확인한다.
라. 결과해석
res
이 진단은 원심을 이용해 불용성의 PrP
를 농축하는 것으로 효소를 처리해 가수분해된 음
c
성대조는 시그널을 보이지 않으며 수용성의 PrP
만 포함한 효소를 처리하지 않은 음성대조는
매우 약한 시그널을 보일 수 있다. 프리온 단백질을 두 번의 glycosylation이 존재해 PK를 처리한
res
res
PrP
의 immunoblot에서는 30-27kDa, 26-24kDa, 21-19kDa의 세 밴드가 나타나며 BSE PrP
의
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