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효소활성을 균일하게 하기 위해, proteinase K 용액을 첨가는 첫째에서 마지막 튜브
표
까지 5분 이내에 빨리 실시한다.
⑥ 잘 혼합 후, 재빨리 항온수조 또는 Heat Block 등에 두고 37±2℃, 10±1분간 반응을
준
실시한다. ⑤와 ⑥의 조작 사이의 시간은 2분 이상 방치해서는 안 된다.
기
⑦ 반응종료 후 2분 이내에 Reagent B를 250㎕ 첨가하여 용액전체가 푸르게 될 때까지
술
잘 혼합한다(Reagent B를 첨가하는 작업은 5분 이내 재빨리 실시한다).
활
⑧ Reagent B를 넣은 후 30분이내에 20℃ 20,000Xg에서 5분간 또는 15,000Xg 7분간
용
원심한다.
⑨ 원심종료 후, 상층액을 폐기한다. 상층액을 가능한 한 제거하기 위해, 튜브를 상하 역
으로 하여 페이퍼 위에 5분간 놓아두어 건조시킨다.
⑩ 건조시킨 후, 10분 이내에 마이크로튜브에 Reagent C을 25㎕ 첨가한다. 여기에서는
볼텍스(vortex)로서 혼합해서는 안 된다.
⑪ 빨리 항온수조 또는 Heat Block 등에 두고 100±5℃, 5±1분간 반응을 실시할 것.
⑩와 ⑪의 조작 사이의 시간은 2분 이상 방치해서는 안 된다.
⑫ 항온수조 또는 Heat Block 등에서 마이크로튜브를 꺼내어, 볼텍스로 잘 혼합한다
(5±2초).(이 시점에서 샘플은 2∼8℃에서 5시간, -20℃에서 72시간 보존가능 하다.
보존한 경우는 실온에서 녹여서 볼텍스하여 잘 혼합한다(5±2초)).
⑬ TeSeE검출킷트의 희석액(R6)를 125㎕ 첨가하여 혼합한다. 희석샘플은 볼텍스로 5±2
초간 잘 혼합하여 PrP 검출 방법에 따라 마이크로플레이트의 웰에 샘플을 분주한다.
2) PrP 검출(TeSeE 검출킷트)
① 마이크로플레이트에서 필요한 수만큼 스트립으로 꺼낸다.(사용하지 않는 스트립은
통에 되돌리고 건조제를 넣은 후 확실히 공기를 제거해가면서 밀폐한다. 2∼8℃에서
1개월간 보존가능)
② 아래와 같이 음성컨트롤(R3), 양성컨트롤(R4) 및 TeSeE 추출킷트로 추출한 샘플을
마이크로플레이트의 웰에 분주한다.
- A1,B1,C1,D1 :
음성컨트롤(R3) 100㎕
-
E1,F1 :
양성컨트롤(R4) 100㎕
-
G1,H1 :
샘플
100㎕
③ 필름으로 피복하여 37±2℃에서 30±2분 반응한다.
④ 필름을 벗기고 플레이트를 세척한다. 자동 마이크로플레이트 워셔기로 세정하는 경우는
오버플로 설정으로 3회 세척한다. 세척종료 후 세척액을 웰에서 완전히 제거하기
위해 페이퍼위에서 액을 털어낸 후 이 상태에서 5분 이상 방치해서는 안 된다.
⑤ 효소표지항체희석액(R7')을 100㎕씩 각 웰에 분주한다.
⑥ 필름으로 피복하여 2∼8℃에서 30±2분 반응한다.
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