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[ 붙임 ] 한국형 SBV의 ultra Real-time PCR(초고속 실시간 정량 PCR) 진단법
연
구
1. 준비물
성
○ 가검시료 : 낭충봉아부패병에 감염되었거나 의심되는 꿀벌, 애벌레 등 시료
과
○ ultra Real-Time PCR 재료 : RNA 추출키트, cDNA 합성키트, 프라이머세트, ultra
활
Real-time PCR, 2X MicroPCR Master Mix 등
용
집
2. 프라이머
○ 프라이머 제작
Table 1. KSBV ultra Real-time PCR 진단을 위한프라이머 세트
Name
Primer sequence(5' →3')
Position
bp
KSBV URRT F
5`-GACCAAGAAGGGAATCAG-3`
2306-2428
123
KSBV URRT123R
5`-CATCTTCTTTAGCACCAGTATCCA-3`
3. 방법
1) ultra Real time PCR법
○ RNA 추출 키트를 이용하여 가검물(꿀벌, 애벌레 등)로부터 total RNA를 추출하고 cDNA
합성키트를 이용하여 cDNA를 합성한다.
○ Primer 10pmole 각 1㎕, cDNA 1㎕을 2X MicroPCR master mix에 넣고 총 양을 6㎕로
맞춘다.
○ ultra Real-Time PCR 기계를 이용하여 다음과 같이 PCR을 실시한다.
Step
Temp/Time
Cycle
Predenaturation
94℃, 30sec
1 cycle
Denaturation
94℃, 1sec
Annealing
54℃, 10sec
35 cycles
Extension
72℃, 3sec
Melting analysis
72℃~82℃(0.1℃/sec)
4. 판독
○ Real time PCR 장비와 연동되어 있는 소프트웨어를 이용하여 Ct 값을 확인하고, 해당 식
에 따라 정량하거나, 증폭산물을 전기 영동하여 123bp의 밴드를 확인한다.
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