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항체를이용하여배아암세포를분리
나) 간전구세포특이단백질확인에의한성상확인기법
? 간전구세포특이발현단백질인AFP, NESTIN, CK18(녹색형광) 및CK19(적색형광)
나. 배아암세포배양기법
을이용하여간전구세포임을확인하였음
o Mouse embryonic fibroblast 및Embryonic carcinoma cell의적정배지및배양조건을
다) 간전구세포특이발현유전자확인에의한성상확인기법
확립
? Real time-PCR법으로간전구세포의특이발현유전자인AFP, G6P, TAT 및
다. 배아암세포성상확인기법
HNF3β의발현을확인하여간전구세포임을확인하였음
1) 작출한마우스배아암세포를20대까지계대배양하면서주기별(5계대)로성상을확인하
라) 세포주기확인에의한성상확인기법
였음
? 마우스배아줄기세포와마우스배아줄기세포유래간전구세포를BrdU 및Phospho-
o 작출한마우스배아암세포는Self-renewal의보조인자(LIF)의존성임을확인하였음
Histone H3를이용한면역조직화학염색법으로간전구세포임을확인하였음
o 작출한마우스배아암세포는형태학적으로세포의밀도가치밀하고둥근형태이며, 다층의응
마) 간전구세포의분화능확인기법
괴(집락)를형성하며feeder cell에비해두꺼운형태를나타내는배아줄기세포임을확인하
(1) 간세포로의분화유도및성상확인기법
였음
(가) 간세포로의분화유도기법
o 작출한마우스배아암세포를효소학적(ALP등)으로성상을확인하였음
o 간전구세포를분화배양배지를이용하여6일동안1차배양
o 전사인자 및 표면항원으로서 각각 Oct-4, Sox-2, Nanog 및 SSEA-1, SSEA-4,
o 1차분화세포를2차분화배양배지를이용하여12일동안2차배양
TRA-1-60을이용하여미분화된마우스배아암세포임을확인하였음
(나) 간세포성상확인기법
? Glycogen 합성능을확인함으로써간세포임을확인하였음
3. 마우스배상체작출및성상확인기법확립
? Real time-PCR법으로 AFP, G6P, TAT 및HNF3β의현저한발현을확인하여
가. 배상체작출기법
간세포임을확인하였음
o Conical tube (CT)법및Low attatchment (LA) hanging drop(HD)법을확립하였으며,
? BrdU 및 Phospho-Histone H3를 이용한 면역조직화학염색법으로 세포주기를확
3가지기법의배상체형성능을비교시험한결과, CT법및LA법은100%, HD법은96%의
인하여간세포임을확인하였음
배상체형성능을나타내었음
(2) 담관세포로의분화유도및성상확인기법
나. 배상체성상확인기법
1) 작출한마우스배상체는feeder cell 비의존성임을확인하였음
(가) 담관세포로의분화유도기법
2) 작출한마우스배상체는Self-renewal의보조인자(LIF) 비의존성임을확인하였음
? Matrigel 코팅dish에서간전구세포2x10
개를Basal medium I에100ng/ml rmHGF와
5
3) 각각의방법으로만든마우스배상체는배양기간중heart-beating현상을관찰함으로써
50ng/ml EGF가첨가된배지로7일간배양
분화능을지닌배상체임을확인하였음
(나) 담관세포성상확인기법
4) 도립(형광)현미경및SEM으로관찰하여형태학적으로배상체임을확인하였음
? 현미경으로형태학적관찰시가지런히정렬된세포로둘러싸인관형태의구조와
5) 투과전자현미경(TEM)으로3가지방법에의해작출한마우스배상체(EB 12d)의중심부
중심부의강을원주상피세포가치밀하게둘러싸고있는구형의3차원구조가관찰됨
는apoptosis 단계의세포들이다량관찰되었으며, 외부의세포들은microvilli가많이
나. 마우스배아줄기세포유래조혈세포작출, 유지배양및성상확인기법확립
발달하였고, secretory vesicle이많이관찰되었음
1) 조혈세포로의분화유도(작출) 및유지배양기법
6) 작출한마우스배상체는신경핵발현물질NeuN, 표면항원물질SSEA-1 및SSEA-4에
? 마우스배아줄기세포(NVRQS-11F)를20ng/ml VEGF 및200ng/ml IGF-II가첨가된배지
대해양성(녹색형광)을나타내는마우스배상체임을확인하였음
로4일간1차배양
? 1차배양세포를50ng/ml SCF, 0.001 unit/ml human EPO, 10ng/ml mouse IL-3 및10
-6
M
4. 마우스배아분화세포등의작출, 성상확인및유지배양기법확립
dexamethasone이첨가된배지로21일간2차배양
가. 마우스배아줄기세포유래간(전구)세포작출, 유지배양및성상확인기법확립
2) 조혈세포성상확인기법
1) 간전구세포작출및유지배양기법
? 배아줄기세포는 세포의 밀도가 치밀하고 둥근 형태로 다층의 집락을 형성하였으나 2
o 0.8% DMSO가첨가된배지를이용하여4일동안1차배양
차분화배양후에는낱개의동그란형태의조혈세포가관찰됨
o 2.5mM sodium butyrate가첨가된배지를이용하여6일동안2차배양
? 조혈세포특이발현단백질인CD-117를이용하여조혈세포임을확인하였음
o 10ng/ml rmHGF가첨가된배지를이용하여12일동안3차배양및유지배양
다. 마우스배아줄기세포유래신경전구세포작출, 유지배양및성상확인기법확립
2) 간전구세포성상확인기법
1) 신경전구세포로의분화유도(작출) 및유지배양기법
가) 형태학적성상확인기법
? 마우스배아줄기세포(NVRQS-11F)를EB배지에서5일간배양하여배상체작출
? 배아줄기세포는세포의밀도가치밀하고둥근형태로다층의집락을형성하였으나
? 1차분화배양에서생성된배상체를0.1% gelatin 코팅plate로옮겨ITSF배지에서8일
3차분화배양후에는세포의크기가커지면서핵이크고어두운과립이침착된간전
간추가배양
구세포가관찰됨
2) 신경전구세포성상확인기법
나) 간전구세포특이단백질확인에의한성상확인기법
? 간전구세포특이발현단백질인AFP, NESTIN, CK18(녹색형광) 및CK19(적색형광)
나. 배아암세포배양기법
을이용하여간전구세포임을확인하였음
o Mouse embryonic fibroblast 및Embryonic carcinoma cell의적정배지및배양조건을
다) 간전구세포특이발현유전자확인에의한성상확인기법
확립
? Real time-PCR법으로간전구세포의특이발현유전자인AFP, G6P, TAT 및
다. 배아암세포성상확인기법
HNF3β의발현을확인하여간전구세포임을확인하였음
1) 작출한마우스배아암세포를20대까지계대배양하면서주기별(5계대)로성상을확인하
라) 세포주기확인에의한성상확인기법
였음
? 마우스배아줄기세포와마우스배아줄기세포유래간전구세포를BrdU 및Phospho-
o 작출한마우스배아암세포는Self-renewal의보조인자(LIF)의존성임을확인하였음
Histone H3를이용한면역조직화학염색법으로간전구세포임을확인하였음
o 작출한마우스배아암세포는형태학적으로세포의밀도가치밀하고둥근형태이며, 다층의응
마) 간전구세포의분화능확인기법
괴(집락)를형성하며feeder cell에비해두꺼운형태를나타내는배아줄기세포임을확인하
(1) 간세포로의분화유도및성상확인기법
였음
(가) 간세포로의분화유도기법
o 작출한마우스배아암세포를효소학적(ALP등)으로성상을확인하였음
o 간전구세포를분화배양배지를이용하여6일동안1차배양
o 전사인자 및 표면항원으로서 각각 Oct-4, Sox-2, Nanog 및 SSEA-1, SSEA-4,
o 1차분화세포를2차분화배양배지를이용하여12일동안2차배양
TRA-1-60을이용하여미분화된마우스배아암세포임을확인하였음
(나) 간세포성상확인기법
? Glycogen 합성능을확인함으로써간세포임을확인하였음
3. 마우스배상체작출및성상확인기법확립
? Real time-PCR법으로 AFP, G6P, TAT 및HNF3β의현저한발현을확인하여
가. 배상체작출기법
간세포임을확인하였음
o Conical tube (CT)법및Low attatchment (LA) hanging drop(HD)법을확립하였으며,
? BrdU 및 Phospho-Histone H3를 이용한 면역조직화학염색법으로 세포주기를확
3가지기법의배상체형성능을비교시험한결과, CT법및LA법은100%, HD법은96%의
인하여간세포임을확인하였음
배상체형성능을나타내었음
(2) 담관세포로의분화유도및성상확인기법
나. 배상체성상확인기법
1) 작출한마우스배상체는feeder cell 비의존성임을확인하였음
(가) 담관세포로의분화유도기법
2) 작출한마우스배상체는Self-renewal의보조인자(LIF) 비의존성임을확인하였음
? Matrigel 코팅dish에서간전구세포2x10
개를Basal medium I에100ng/ml rmHGF와
5
3) 각각의방법으로만든마우스배상체는배양기간중heart-beating현상을관찰함으로써
50ng/ml EGF가첨가된배지로7일간배양
분화능을지닌배상체임을확인하였음
(나) 담관세포성상확인기법
4) 도립(형광)현미경및SEM으로관찰하여형태학적으로배상체임을확인하였음
? 현미경으로형태학적관찰시가지런히정렬된세포로둘러싸인관형태의구조와
5) 투과전자현미경(TEM)으로3가지방법에의해작출한마우스배상체(EB 12d)의중심부
중심부의강을원주상피세포가치밀하게둘러싸고있는구형의3차원구조가관찰됨
는apoptosis 단계의세포들이다량관찰되었으며, 외부의세포들은microvilli가많이
나. 마우스배아줄기세포유래조혈세포작출, 유지배양및성상확인기법확립
발달하였고, secretory vesicle이많이관찰되었음
1) 조혈세포로의분화유도(작출) 및유지배양기법
6) 작출한마우스배상체는신경핵발현물질NeuN, 표면항원물질SSEA-1 및SSEA-4에
? 마우스배아줄기세포(NVRQS-11F)를20ng/ml VEGF 및200ng/ml IGF-II가첨가된배지
대해양성(녹색형광)을나타내는마우스배상체임을확인하였음
로4일간1차배양
? 1차배양세포를50ng/ml SCF, 0.001 unit/ml human EPO, 10ng/ml mouse IL-3 및10
-6
M
4. 마우스배아분화세포등의작출, 성상확인및유지배양기법확립
dexamethasone이첨가된배지로21일간2차배양
가. 마우스배아줄기세포유래간(전구)세포작출, 유지배양및성상확인기법확립
2) 조혈세포성상확인기법
1) 간전구세포작출및유지배양기법
? 배아줄기세포는 세포의 밀도가 치밀하고 둥근 형태로 다층의 집락을 형성하였으나 2
o 0.8% DMSO가첨가된배지를이용하여4일동안1차배양
차분화배양후에는낱개의동그란형태의조혈세포가관찰됨
o 2.5mM sodium butyrate가첨가된배지를이용하여6일동안2차배양
? 조혈세포특이발현단백질인CD-117를이용하여조혈세포임을확인하였음
o 10ng/ml rmHGF가첨가된배지를이용하여12일동안3차배양및유지배양
다. 마우스배아줄기세포유래신경전구세포작출, 유지배양및성상확인기법확립
2) 간전구세포성상확인기법
1) 신경전구세포로의분화유도(작출) 및유지배양기법
가) 형태학적성상확인기법
? 마우스배아줄기세포(NVRQS-11F)를EB배지에서5일간배양하여배상체작출
? 배아줄기세포는세포의밀도가치밀하고둥근형태로다층의집락을형성하였으나
? 1차분화배양에서생성된배상체를0.1% gelatin 코팅plate로옮겨ITSF배지에서8일
3차분화배양후에는세포의크기가커지면서핵이크고어두운과립이침착된간전
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구세포가관찰됨
2) 신경전구세포성상확인기법
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