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5. 연구용역 과제일람표 / 아. 농림축산검역검사 R&D 연구용역
제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법
▣ 임상검체 수집
○ 항원탐색을 위한 혈청: 기 확보된 혈청을 사용
- 우결핵병 혈청, M. avium 감염혈청, 비감염 우혈청
- M. avium 감염혈청은 수의과학검역원으로부터 제공받음.
○ 진단적인 유의성 탐색을 위한 우혈청 확보
- PPD 피부반응검사를 실시하여 PPD 양성 및 음성 혈청 각각 50개 이상 확보
○ PPD 피부반응검사
- 결핵병 및 브루셀라병 방역실시요령(농림수산식품부고시 제2009-147호)에 의거 PPD 피부반응
검사를 가축위생시험소 및 축산진흥연구소와 공동으로 수행
- 간단히 기술하면, 국내 사육중인 생후 12개월 이상의 소에 대해 농림수산검역검사본부로부터
분양받은 PPD 진단액을 미근부 추벽의 피내 접종함. 그 후 48-72시간 경과한 시점에서 피부
두께를 측정하였음.
- 판정: 접종전과 접종후의 종창차이가 5 mm 이상 양성, 3-5 mm 의양성, 3 mm 이하 음성으로
판정
- 양성 및 음성혈청 각각 50개 이상 전혈을 채취하여 시험에 공시
▣ 결핵의 혈청학적 진단항원으로부터 우결핵 진단항원 발굴
○ 본 연구팀이 그동안 proteomic 기법을 통해 발굴 및 확보한 사람결핵의 혈청학적 진단항원 library
로 부터 우결핵의 진단적인 유의성이 있는 항원을 탐색함.
- 대표적인 항원으로 HspX(Rv2031c), HBHA, FAP-A, MPB83, Ag85, CysA2 등의 항원임.
▣ 우결핵균 배양액으로부터 새로운 혈청학적인 진단항원 발굴
○ 우결핵균 (M. bovis AN5) 배양액을 농축하여 M. bovis 감염 우혈청(x1000)과 M. avium감염 혈청
(x1000)으로 immunoblot을 실시하거나 또는 복잡한 배양액을 부분 분획화를 실시하여
immunoblotting을 실시하여 분석하였음.
- M. bovis 배양농축액을 일차로 ammonium sulfate와 hydrophobic interaction chromatography를 적용
하여
분획화를
실시하고,
및
1DE(SDS-PAGE)와
2-DE(2-dimensional
electrophoresis)
Immunoblotting으로 분석함. 이와 같이 분획화를 실시하면 minor한 단백 band가 농축되는 효과를
얻을 수 있기 때문에 보다 다양한 항원을 발굴할 수 있음.
○ 예비실험결과를 바탕으로 배양액에 존재하는 지질성분이 혈청학적 단백분석을 방해하기 때문에
Triton X-114를 이용하여 phase separation 통해 지질분획을 제거하고 분석을 실시함.
○ 흥미로운 단백질 spot은 연세대학교 프로테움연구센터에 의뢰하여 LC-MS/MS로 동정함.
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