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농림축산검역검사기술개발사업2013 연구보고서
Fig 2. Strategies of identification of the proteins with seroreactivity from M. bovis culture
filtrate
▣ 단백항원의 생산
○ 최종적으로 동정된 모든 단백의 유전자를 발현벡터인 pET벡터에 클로닝하여 대장균에 형질전환
시켜 재조합단백질을 생산함.
○ 발현된 단백질은 Ni-NTA affinity chromatography를 이용하여 정제하고, 일차적인 진단적 유용성을
확인한 후 대량 정제하여 확보함.
▣ 우결핵균 또는 결핵균체로부터 진단적인 유용성이 있는 지질항원 발굴
○ 예비실험결과 결핵균 세포벽에 존재하는 LAM, LM (lipomannan), PIM 등에 대해 높은 항체 반응
을 나타냄.
○ 실제 우결핵균 배양농축액을 Triton X-114로 위상분리(phase separation)하면 수용성 분획의 단백질
분획과 계면활성분획의 지질분획으로 분리됨. 이들 지질분획에 대해 M. bovis 감염 우혈청(x1000)
과 M. avium감염 혈청(x1000)으로 immunoblotting을 실시한 결과 LAM과 PIM 부위에 강한 항체반
응이 관찰되었음.
■ 발굴된 항원의 혈청학적 진단적인 유의성 평가
○ 발굴된 항원 각각에 대해서는 수의과학검역원과 경상대 김석교수가 확보한 우혈청을 이용하여
ELISA 또는 immunoblotting으로 유의성을 평가함.
○ 개별 항원들을 조합하는 경우 최적의 민감도를 달성하는 항원 조합군을 선별함
○ 진단시스템으로 ELISA와 immunoprint assay를 비교 분석
- ELISA: 단일 항원에 대한 ELISA 결과 분석을 통해 항원조합 결과를 분석
Multi-antigen print immunoassay: 다중항원을 nitrocellulose membrane 에 printing
-
(semiautomated airbrush printing devise, Linomat)하여 immunoblot으로 분석
1814 농림축산검역본부

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