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농림축산검역검사기술개발사업 2015 연구보고서
- IPTG를 넣지 않은 것에 비해 IPTG를 넣고 배양했을 때 Phi29의 단백질이 발현되
는 것을 알 수 있고 상등액층에서 발현되는 것으로 보아 가용성 단백질로 생각됨
- 발현된 단백질이 있는 상등액을 0.2 μm nylon membrane filter로 filtration
후 DNase I 100 μl 첨가하고 waving shaker에서 10분 처리
- Phi29를 분리 정제하기 위해 pGS21a-Phi29 vector에 있는 His tag을 이용하여
+
4℃에서 Ni
-NTA column으로 단백질 추출
- 위에서 추출된 단백질을 다시 한 번 깨끗이 정제하기 위해 pGS21a-Phi29 vector
에 있는 GST tag을 이용하여 4℃에서 GST affinity column으로 추출
- PAGE로 Phi29 단백질 확인
그림8. His tag과 GST tag을 이용한 Phi29 단백질의 분리 및 정제
F: column을 단순 통과한 뒤 나온 단백질시료, W: washing buffer로 세척 되어
나온 단백질, E: column에 결합하여 있다가 elution buffer를 처리하고 난 뒤 얻은
단백질시료, 1∼4: GST column에 elution buffer를 처리하여 얻은 단백질 시료
fraction. □ : Phi29 단백질 부분
⑦ 정제된 Phi29를 이용한 Multiple Displacement Amplification (MDA)시험 및
오염여부 측정
- GST column을 통과하여 추출 된 단백질 fraction 중 정량하여 가장 많은 Phi29
중합효소를 포함하고 있는 그림8의 2번 fraction을 선택
- Phi29를 이용한 MDA시험 및 오염여부 측정을 하기 위해 DNA sample과 멸균수
를 준비하여 Phi29를 30℃에서 16시간 처리 후 전기영동으로 agarose gel 상에
서 확인
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농림축산검역본부

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